近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心，以下简称“基因组所”）萧玉涛团队在《公共科学图书馆-生物学（PLoS Biology）》在线发表了题为“Retrotransposon-mediated disruption of a chitin synthase gene confers insect resistance to Bacillus thuringiensis Vip3Aa toxin”的研究论文。该研究发现了一个极为重要的Vip抗性基因。该研究首次证实，中肠几丁质合成酶（Chitin synthase 2, CHS2）变异参与介导了草地贪夜蛾对Vip3Aa的高水平抗性。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）产生的杀虫蛋白已被广泛应用于害虫防治近一个世纪，有效保护了作物免受虫害。然而，Bt作物长年大规模的种植，不可避免地导致靶标害虫对其演化出抗性。目前，已报道害虫对转Bt-Cry蛋白作物产生田间抗性（practical resistance）案例不低于26例，分布于7个国家，包含11种靶标害虫。为了对抗害虫对Cry蛋白的抗性，农民开始种植同时产生Cry蛋白和Vip3Aa的转基因作物。Vip3Aa蛋白是Bt在营养阶段产生的杀虫蛋白，拥有较好的杀虫功效，且与Cry蛋白的杀虫作用模式不同。

近年来，鳞翅目害虫美洲棉铃虫（Helicoverpa zea）和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）对Vip3Aa具有田间抗性的早期预警已有报道。因此，迫切需要了解靶标害虫对Vip3Aa产生抗性的遗传基础，用于田间抗性监测和管理。这对于全球重要入侵害虫草地贪夜蛾尤为重要，该害虫自2018年底由云南边境入侵我国，目前已将其分布范围从美洲扩展到非洲、亚洲和澳大利亚。它较强的适应性、繁殖能力以及远距离迁徙能力对入侵地农作物的安全生产造成严重威胁。

研究人员首先采集了草地贪夜蛾田间种群，通过室内连续筛选，获得了抗性稳定遗传的Vip3Aa抗性品系（Sfru_R3）。生物测定结果表明，该抗性品系拥有相对于敏感品系约5,560倍的Vip3Aa抗性，且与Cry毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa）不存在交互抗性。遗传特征分析结果表明，该抗性性状为常染色体、不完全隐性遗传，且由单遗传位点控制。为了明确介导该抗性的遗传基础，研究人员首先构建了F2性状分离群体，通过BSA（bulked segregant analysis）定位到位于1号染色体上长度约为4.4 Mb（6.56-10.92 Mb）的遗传区间（图1）。在此基础上，进一步通过精细定位（fine-mapping），将候选遗传区间缩小至0.75 Mb（8.17-8.62 Mb）。该候选遗传区间内共有19个基因被注释，结合这19个基因的转录水平及其蛋白结构，最终将目标基因锁定为SfCHS2。目标基因为几丁质合成酶基因，且在中肠特异性高表达，其编码蛋白为拥有多个跨膜结构域的膜蛋白。

图1 基于BSA和精细定位的Vip3Aa抗性基因鉴定

通过Sanger测序，对SfCHS2分别在SS和Sfru_R3品系的基因组序列比较分析发现，相比于SS品系，Sfru_R3品系SfCHS2基因组序列存在长度约为6.4 Kb的大片段插入（图2）。通过BLAST比对分析，鉴定该插入序列为长末端重复-逆转录转座子（long terminal repeat retrotransposon，LTR），并将这个转座子序列命名为Yaoer（幺蛾）。通过序列分析进一步发现，Yaoer的插入位点比较特殊，刚好位于21号外显子和21号内含子之间，且原始剪接位点序列并未受到影响。与此同时，Yaoer的插入引入了一个新的剪接位点，位于Yaoer的3’端与21号内含子5’端之间。新引入的剪接位点，理论上会扰乱21号内含子的正确剪切。为了验证这个假设，研究人员通过特异性引物扩增得到的PCR产物以及全长转录组测序（Iso-Seq）分析发现，就exon21-intron21-exon22区间而言，SS品系SfCHS2只有一种转录本，即野生型转录本。然而，Sfru_R3品系SfCHS2却同时拥有野生型转录本和多种突变转录本。尽管属于不同类型的突变转录本，但与野生转录本相比，突变转录本均只能产生一种缺失了C7结构域的不完整SfCHS2蛋白。

而且，通过RT-qPCR分析发现，SfCHS2总转录本（total transcripts）的转录水平在SS和Sfru_R3之间不存在显著性差异。然而，与SS相比，Sfru_R3品系SfCHS2野生型转录本（wild-type transcripts）的转录水平显著性降低，只有SS的1/12。与此同时，遗传连锁分析结果表明，Sfru_R3品系SfCHS2野生型转录本的低转录水平与Vip3Aa抗性遗传连锁（图2），暗示SfCHS2野生型转录本降低可能是介导Sfru_R3产生高水平抗性的直接原因。

图2 Vip3Aa抗性品系SfCHS2逆转录转座子插入鉴定及其遗传连锁分析

为了验证SfCHS2的功能紊乱能介导草地贪夜蛾对Vip3Aa产生高水平抗性这一假设，研究人员进一步通过基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术，构建了3个草地贪夜蛾SfCHS2敲除纯合品系（SfCHS2-KO-A/B/C）。生测结果表明，3个草地贪夜SfCHS2敲除品系均对Vip3Aa表现出>12,000倍的高水平抗性（图3）。同时，遗传互补实验结果发现，SfCHS2敲除品系与Sfru_R3交配后所产F1子代同样对Vip3Aa拥有极高的抗性水平。该结果表明，介导Sfru_R3对Vip3Aa产生高水平抗性的遗传位点与SfCHS2所在位点相一致。

图3 CRISPR/Cas9介导的SfCHS2基因敲除及其Vip3Aa敏感性分析

在明确了Yaoer插入SfCHS2能够介导草地贪夜蛾对Vip3Aa产生高水平抗性后，研究人员对来自全球540份草地贪夜蛾重测序数据进行了比对分析，结果发现，其中有1个于2020年采自广东省江门市田间的样本，携带有与Sfru_R3品系相同的SfCHS2抗性等位基因，且该个体为SfCHS2突变纯合体。

此外，为了进一步明确由CHS2介导的Vip3Aa抗性机制是否存在物种特异性，研究人员同时还构建了另外2种鳞翅目害虫斜纹夜蛾和东方黏虫的CHS2敲除品系，生测结果显示，这2种鳞翅目害虫的CHS2敲除品系分别对Vip3Aa表现出 >100,000和 >1,330倍的高水平抗性，暗示CHS2参与介导Vip3Aa抗性的机制可能是鳞翅目昆虫共有的机制，同时也暗示，CHS2在Vip3Aa对不同鳞翅目害虫作用模式中所发挥的功能具有一定程度的保守性。

综上所述，该研究通过正向、反向遗传学研究手段证实了CHS2能介导至少3种鳞翅目害虫对Vip3Aa的高水平抗性。SfCHS2基因Yaoer插入事件在田间样本的发现，对于田间Vip3Aa抗性的监测和管理具有十分重要的意义。有必要对已报道的其他靶标害虫Vip3Aa高抗品系CHS2基因进行Yaoer插入变异以及其他可能导致CHS2功能紊乱的变异检测。同时，有必要在田间大范围地检测靶标害虫是否携带导致CHS2功能紊乱的变异，尤其是已经长时间种植转Vip3Aa作物的地区。此外，结合此前相关研究表明，尽管介导靶标害虫对Vip3Aa产生抗性的遗传基础可能存在多样性，然而，相对而言，对田间靶标害虫CHS2的变异监测将更加重要。总而言之，该研究所得结论，对田间靶标害虫Vip3Aa抗性管理与监测具有里程碑式的意义，是该团队去年报道首个Vip抗性基因（PNAS, 2023）之后的又一重要成果。

基因组所博士后刘振兴、助理研究员廖重宇、博士后邹路明、研究员靳明辉以及博士生单银雪为论文的共同第一作者。萧玉涛研究员、吴孔明院士和德国马普生态所David G. Heckel教授为论文的共同通讯作者。美国科学院院士Bruce E. Tabashnik教授以及华中师范大学的刘凯于教授参与了该项研究的相关工作。该研究得到了国家自然科学基金、中国农科院创新工程等项目的资助。

原文链接：https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002704

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