近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）徐炜课题组联合清华大学孙前文课题组与孟安明课题组开发了一项高精度、超微量R-loop定量测序技术ULI-ssDRIP-seq，并基于该项技术揭示了R-loop在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基因组动态分布模式及生物学功能。该研究成果以“ULI-ssDRIP-seq revealed R-loop dynamics during vertebrate early embryogenesis”为题在线发表于《细胞洞察（Cell Insight）》。

R-loop由一条DNA:RNA互补杂合双链及另一条未配对的DNA单链构成，广泛存在于从原核生物到人类的各物种基因组中，并通过调控基因表达、DNA损伤与修复、基因组表观遗传学修饰等重要生物学过程影响着生命体的各种活动。在斑马鱼（Danio rerio）中，R-loop可以通过影响tRNA基因转录对早期胚胎发育过程进行调控[1]，还参与胚胎神经元[2]、造血干/祖细胞（HSPCs）的发育调控[3]。亲本-合子转变（Parental to zygotic transition）是早期发育的第一个关键事件，主要由母源mRNA降解和合子基因组激活（ZGA）介导。以往的研究显示，组蛋白修饰等表观遗传因子在亲本-合子转变过程中发生了广泛的重编程[4]。但R-loop在脊椎动物早期胚胎发育过程中的动态变化模式之前未见报道，主要原因是原先的各类R-loop测序技术灵敏度有限，无法用于细胞数极少的超微量样本。

为了解决上述问题，研究团队基于高效单链DNA接头预先连接方案，通过重构技术流程，实现了一管式建库，大幅减少了样本损失，最终成功开发出了超高分辨率、超微量R-loop测序技术ULI-ssDRIP-seq（图1A）。该项技术将细胞需求量降低至1000个，并且将分辨率提升至接近单核苷酸水平。进一步，研究团队通过引入异源gDNA作为spike-in对照，结合R-loop文库与input文库数据，实现了对R-loop的定量检测（图1B）。

图1 ULI-ssDRIP-seq技术概况

（a）ULI-ssDRIP-seq流程示意图；（b）ULI-ssDRIP-seq定量分析流程示意图。

研究团队使用ULI-ssDRIP-seq绘制了斑马鱼从配子到早期胚胎的R-loop动态变化图谱（图2A），并通过数据分析揭示了R-loop在早期胚胎发育过程中的动态变化模式。数据显示，穹顶期胚胎上调的R-loop显著富集于增强子区域，表明R-loop有可能参与增强子介导的ZGA过程（图2B）。为了证明该猜想，研究团队基于dCas9系统，结合R-loop特异性水解酶RNase H1，开发了适用于斑马鱼的R-loop靶向编辑系统。通过R-loop靶向编辑系统下调重要合子基因sox3或has2上游增强子的R-loop水平后，可以分别造成这两个基因的表达下降，证明R-loop确实参与了合子基因激活过程的调控。进一步实验证明，通过敲低或过表达RNase H1来上调或下调全基因组R-loop水平均会导致胚胎发育延迟，并使基因表达模式发生显著变化（图2C）。其中，上调R-loop引起的胚胎发育受阻现象尤为明显，并且这个过程是依赖于p53途径的。综上所述，该研究构建了首个脊椎动物亲本-合子转变过程中的R-loop动态图谱，并揭示了稳定的R-loop动态变化模式在维持早期胚胎正常发育过程中的功能。

图2 R-loop在斑马鱼早期胚胎发育过程中的动态分布及功能研究

（a）所检测各时期胚胎样本示意图；（b）256细胞时期及穹顶期胚胎ULI-ssDRIP-seq及RNA-seq信号IGV截图，图中展示了has2基因及上游增强子区域。

中国农业科学院深圳农业基因组研究所徐炜研究员、清华大学博士生刘鑫、基因组所博士生李谨谨、博士后孙长斌、清华大学陈露西博士为论文的共同第一作者。清华大学孙前文副教授、孟安明院士、基因组所徐炜研究员为共同通讯作者。该工作也得到了清华大学周劲聪博士、李宽博士及李沁博士的帮助。该研究工作得到了国家自然科学基金、中国农业科学院青年创新专项以及国家重点研发计划的支持。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cellin.2024.100179

参考文献：

1.Chen L, Xu W, Liu K, Jiang Z, Han Y, Jin H, Zhang L, Shen W, Jia S, Sun Q et al. 5' Half of specific tRNAs feeds back to promote corresponding tRNA gene transcription in vertebrate embryos. Science Advances 2021, 7(47):eabh0494.

2. Sorrells S, Nik S, Casey MJ, Cameron RC, Truong H, Toruno C, Gulfo M, Lowe A, Jette C, Stewart RA et al. Spliceosomal components protect embryonic neurons from R-loop-mediated DNA damage and apoptosis. Disease models & mechanisms 2018, 11(2).

3. Weinreb JT, Ghazale N, Pradhan K, Gupta V, Potts KS, Tricomi B, Daniels NJ, Padgett RA, De Oliveira S, Verma A et al. Excessive R-loops trigger an inflammatory cascade leading to increased HSPC production. Developmental cell 2021, 56(5):627-640 e625.

4. Zhang B, Wu X, Zhang W, Shen W, Sun Q, Liu K, Zhang Y, Wang Q, Li Y, Meng A et al. Widespread Enhancer Dememorization and Promoter Priming during Parental-to-Zygotic Transition. Molecular cell 2018, 72(4):673-686 e676