植物环肽类物质来源广泛且化学结构及生物活性多样，具有代谢稳定性强、口服利用度高的特点，然而不同类型植物环肽的生物合成机理多样，石竹科-类型环肽作为植物环肽类物质第二大类群，在抗菌、抗肿瘤等方面的活性极具开发和利用潜力。太子参（Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax,）属于石竹科的草本植物，为典型的药食两用的传统中药材，具有益气健脾、生精润肺的功效。《中国药典》明确规定太子参环肽B为其药用品质的标志性成分，在改善神经性损伤引起的记忆缺失和二型糖尿病等方面具有显著作用，但其生物合成途径尚不清楚，严重制约环肽类物质的开发和利用。

近日，《植物通讯（Plant Communications）》上在线发表了中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）合成生物学研究中心李伟课题组联合福建农林大学林文雄教授团队题为“Identification of a key peptide cyclase for novel cyclic peptide discovery in Pseudostellaria heterophylla”的研究论文。该研究通过多组学关联分析和底盘表达等多种合成生物手段，筛选到环肽类物质生物合成关键环化酶基因，解析其切割和环化活性，阐明催化机理，并利用该关键酶和植物底盘发掘和合成多个太子参的新环肽。该研究突破了植物中低含量天然产物发掘的瓶颈，推动反向遗传学在物质发掘和合成生物学中的应用。

本研究采用合成生物学研究策略，利用基因组、转录组和代谢组数据，筛选环肽类物质合成前体蛋白基因和环化酶基因，并借助本氏烟草瞬时表达体系、体外酶活体系及基因沉默（VIGS）体系阐明了关键环化酶的功能，开发了一套基于前体蛋白基因指导的新环肽类物质植物底盘发掘平台。通过化学合成的已知环肽标准品（HB/PE/PF/PG），借助中心代谢平台的高分辨率液相质谱（Q ExactiveTM HFX）构建环肽类物质检测平台，明确了太子参环肽类物质在根中积累的特点。通过对不同组织部位候选基因的表达量分析，发现2个PhOLP1基因和3个PhPCY1基因在根中高表达，环肽类物质含量与候选基因Person相关性分析结果表明上述5个基因与之环肽类物质含量显著正相关。

图1 太子参环肽类物质合成候选基因筛选

本氏烟草瞬时表达体系共表达前体蛋白基因和候选合成酶基因，结果表明PhPCYs中的PhPCY3催化太子参环肽B的生物合成，通过原核克隆表达纯化带MBP标签环化酶的蛋白，合成线性的HB [14-35]、HB [14-21]底物和HB [22-35]，体外酶活实验结果表明环化酶可以催化HB[14-35]生成HB和副产物HB [22-35]，但不能直接催化线性化HB[14-21]生成HB；利用太子参体内的基因沉默（VIGS）体系沉默关键环化酶基因能显著降低其基因的表达量和对应环肽类物质含量。

图2 太子参环肽类物质合成关键环化酶基因功能验证

通过分子对接环化酶与不同的前体蛋白底物（PreCPs），筛选不同底物与环化酶活性中心关键催化位点，结合氨基酸序列中Prolyl oligopeptide domain序列比对分析，发现文献报道的环化酶关键三联体（Traid）氨基酸位点（S/D/H）在没有活性的PhPCY1/2蛋白中保持保守，而活性中心4?内的N500和S502为不同底物与环化酶之间共有的关键活性位点，定点突变上述位点则能显著降低环化酶的催化活性。

图3 定点突变环化酶的关键催化位点N500和S502降低其催化活性

从不同栽培品种太子参转录组中筛选到环肽的前体蛋白基因110多肽条，其中100多条序列为潜在的新环肽类物质，利用本氏烟草的植物底盘筛选到多个新的环肽类物质，包括cyclo-[LDGPPPYF], cyclo-[WGSSTPHT],cyclo-[GLPIGAPWG] 和cyclo-[FGDVGPVI]，发掘的新环肽可用于未来生物活性的筛选和利用。

图4 前体蛋白基因指导的太子参新环肽的发掘

基因组所（大鹏湾实验室）博士后秦贤金为论文第一作者，王凤姣博士、谢德金博士后和周齐博士参与研究项目，福建农林大学林生教授和林文雄教授提供了太子参基因组和转录组数据支持，福建农林大学林文雄教授和基因组所(大鹏湾实验室)李伟研究员为论文的共同通讯作者，论文得到重点研发项目和国家自然科学基金项目的资金支持。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S259034622500077X