近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）联合武汉大学中南医院在学术期刊《自然·通讯（Nature Communications）》上在线发表了题为“CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same-site indels”的研究论文。该研究利用蛋白进化和理念创新，实现对同一基因位点上大量不同类型的突变（indels）进行快速、精准且简便的检测。CoHIT检测技术采用了一管法操作流程，从样品准备到最终结果读取，整个过程在常温下仅需30分钟，且能精准检测到万分之一的核酸变异。该技术有望在精准分子育种、食品安全监控、传染病早期预警、遗传疾病筛查及肿瘤精准诊疗等多个领域中发挥重要作用。

精准核酸检测在疾病诊断、精准医疗及农业应用等领域具有重要意义。然而，目前临场快速核酸检测方法在面对同一基因位点的多种indels时，往往面临检测覆盖率不足的挑战。为了解决这一问题，研究团队利用蛋白进化技术筛选出具有高耐受度的Cas蛋白，并创新性地提出了利用单一crRNA识别多种突变类型的理念，成功构建了CoHIT（Cas12a-based One-for-all High-speed Isothermal Test）新型CRISPR检测平台。

图1 | CoHIT检测技术

CoHIT系统的核心在于一种改良的AsCas12a蛋白，即enAsU-R，它仅需一条crRNA就能靶向多个不同的变异体。通过对AsCas12a的功能区域进行氨基酸替换，研究人员成功提高了蛋白的错配耐受性和PAM性能，使其能识别与crRNA序列有少量碱基错配的靶标DNA。在CoHIT检测系统中，Cas12a/crRNA复合体能识别并切割多个Indel变异体，从而触发ssDNA切割活性，释放出荧光信号，而野生型DNA则由于与crRNA识别序列的不同而无法引发荧光信号，保证了检测的特异性。

图2 | 对Cas12a变体进行工程改造以提高错配耐受性

通过一系列参数优化，包括缓冲液配方、反应温度和组分浓度调整，CoHIT技术对NPM1基因突变的常见亚型达到了0.01%的检测灵敏度，且在30分钟内迅速给出结果，同时有效避免了野生型DNA的交叉反应。这一特性使得CoHIT在急性髓系白血病（AML）患者NPM1突变检测中表现卓越，准确检测出108名患者中的30名携带NPM1突变个体，且在监测微小残留病灶（MRD）方面展现了巨大的潜力。

图3 | 使用CoHIT系统检测临床样本和MRD

此外，通过与侧向流检测条（LFA）和微流控芯片的结合，CoHIT系统的适应性和多重检测能力得到了显著提升，为现场即时检测提供了可能。研究人员建立了CoHIT-LFA系统，实现了现场快速检测。同时，CoHIT技术与微流控装置集成，通过一次上样即可同时检测7个靶标，展示了CoHIT检测的灵活性和多路复用潜力。

图4 | CoHIT-LFA系统及基于微流控芯片的CoHIT检测

CoHIT技术的成功研发和不断优化，不仅简化了检测流程，还大大提升了检测速度与准确性，为分子育种、疾病早期诊断、遗传病筛查和食品安全监测等众多领域提供了强有力的工具。

武汉大学中南医院博士后刘银和中国农业科学院深圳农业基因组研究所刘馨怡副研究员为该论文共同第一作者，武汉大学中南医院周芙玲教授和中国农业科学院深圳农业基因组研究所王鑫杰研究员与李奎教授为该论文共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金、广东省粤深联合基金、深圳市杰出人才项目的支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49414-7